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免疫熒光的實驗步驟及建議
發布時間:2018-03-20 點擊次數:595次
   免疫熒光将熒光素标記在相應的抗體上,直接與相應抗原反應。其優點是方法簡便、特異性高,非特異性熒光染色少。缺點是敏感性偏低;而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。免疫熒光此法常用于細菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。
  
  免疫熒光步驟基本一緻:
  
  1.取出細胞爬片放到35mm或60mm用過的細胞培養皿裡,PBS洗三遍。注意:有的時候作的細胞爬片可能比較小,因此夾取的時候要小心,注意反正面,放在皿裡洗比較方便,避免了來回夾取,另外洗的時候加PBS不要太沖,不要細胞沖下來。洗的時候我都是多加PBS,稍晃一下就倒掉,沒有等5分鐘或10分鐘。
  
  2.4%冷的多聚甲醛固定20分鐘,PBS洗三遍。
  
  3.0.2%TritonX-100通透10分鐘,PBS洗三遍。
  
  4.與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘,PBS洗三遍。
  
  5.一抗4度濕盒内過夜,也可37度2小時,感覺前者效果好,PBS洗三遍。
  
  6.二抗室溫2小時(避光),或者37度1半小時,PBS洗三遍。
  
  7.zui好用DAPI染核,然後直接照熒光片。
  
  8.蒸餾水洗掉PBS,甘油封片,指甲油封片子的四周,因為甘油不象樹脂那樣會幹,所以不用指甲油封的話會弄的一塌糊塗。
  
  建議:1.還是染完之後沒有封片前直接照一些,因為有的時候可能封片會出現問題,再想照反而沒有了,另外不要拖太長時間,熒光會崔滅的。2.免疫熒光的片子一定要避光保存,保存的好的話,過一段時間仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定離心,不然有的時候有那種沉澱,在片子上就是一個很大的非特異性熒光光點,非常難看。

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