王中王鉄算盘开奖结果歡迎您的到來!

當前位置:

首 頁 > 資料下載 > ELISA操作要點
産品搜索 Search

資料下載Down

ELISA操作要點

提 供 商: 王中王鉄算盘开奖结果 資料大小:
圖片類型: 下載次數: 2 次
資料類型: 浏覽次數: 1296次
相關産品:
詳細介紹
的試劑,良好的儀器和正确的操作是保證ELISA檢測結果準确可靠的必要條件。ELISA的操作因固相載體的形成不同而有所差異,國内醫學檢驗一般均用闆式點。本文将叙述闆式ELISA各個操作步驟的注意要點,珠式、管式及磁性球ELSIA,國外試劑均與特殊儀器配合應用,兩者均有詳細的使用說明,嚴格遵照規定操作,必能得出準确的結果。
一、标本的采取和保存
可用作ELISA測定的标本十分廣泛,體液(如血清)、分泌物(唾液)和排洩物(如尿液、糞便)等均可作标本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些标本可直接進行測定(如血清、尿液),有些則需經預處理(如糞便和某些分泌物)。大部分ELISA檢測均以血清為标本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外,其他成份均同等于血清。制備血漿标本需借助于抗凝劑,而血清标本隻要待血清自然凝固、血塊收縮後即可取得。除特殊情況外,在醫學檢驗中均以血清作為檢測标本。在ELISA中血漿和血清可同等應用。血清标本可按常規方法采集,應注意避免溶血,紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質,以HRP為标記的ELISA測定中,溶血标本可能會增加非特異性顯色。
血清标本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染,菌體中可能含有内源性HRP,也會産生假陽性反應。如在冰箱中保存過久,其中的可發生聚合,在間接法ELISA中可使本底加深。一般說來,在5天内測定的血清标本可放置于4℃,超過一周測定的需低溫冰存。凍結血清融解後,蛋白質局部濃縮,分布不均,應充分混勻宜輕緩,避免氣泡,可上下颠倒混和,不要在混勻器上強烈振蕩。混濁或有沉澱的血清标本應先離心或過濾,澄清後再檢測。反複凍融會使抗體效價跌落,所以測抗體的血清标本如需保存作多次檢測,宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應注意無菌操作,也可加入适當防腐劑。
二、試劑的準備
按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水,包括用于洗滌的,應為新鮮的和高質量的。自配的緩沖液應用pH計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡後使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存。
三、加樣
在ELISA中一般有3次加樣步聚,即加标本,加酶結合物,加底物。加樣時應将所加物加在ELISA闆孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出,不可産生氣泡。加标本一般用微量加樣器,按規定的量加入闆孔中。每次加标本應更換吸嘴,以免發生交叉污染,也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測定(如間接法ELISA)需用稀釋的血清,可在試管中按規定的稀釋度稀釋後再加樣。也可在闆孔中加入稀釋液,再在其中加入血清标本,然後在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。加酶結合物應用液和底物應用液時可用定量多道加液器,使加液過程迅速完成。
四、保溫
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應,即加标本和加酶結合物後。抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時間,這一保溫過程稱為溫育(incubation),有人稱之為孵育,在ELISA中似不恰當。
ELISA屬固相免疫測定,抗原、抗體的結合隻在固相表面上發生。以抗體包被的夾心法為例,加入闆孔中的标本,其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會,隻有zui貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程,因此需經擴散才能達到反應的終點。在其後加入的酶标記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什麼ELISA反應總是需要一定時間的溫育。
溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃(冰箱溫度)等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度,也是大多數抗原抗體結合的合适溫度。在建立ELISA方法作反應動力學研究時,實驗表明,兩次抗原抗體反應一般在37℃經1-2小時,産物的生成可達頂峰。為加速反應,可提高反應的溫度,有些試驗在43℃進行,但不宜采用更高的溫度。抗原抗體反應4℃更為徹底,在放射免疫測定中多使反應在冰箱中過夜,以形成zui多的沉澱。但因所需時間太長,在ELISA中一般不予采用。
保溫的方式除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外,一般均采用水浴,可将ELISA闆置于水浴箱中,ELISA闆底應貼着水面,使溫度迅速平衡。為避免蒸發,闆上應加蓋,也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋闆孔,此時可讓反應闆漂浮在水面上。若用保溫箱,ELISA闆應放在濕盒内,濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等,在盒底墊濕的紗布,zui後将ELISA闆放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規定的溫度,特别是在氣溫較低的時候更應如此。無論是水浴還是濕盒溫育,反應闆均不宜疊放,以保證各闆的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應,操作時的室溫應嚴格限制在規定的範圍内,标準室溫溫度是指20-25℃,但具體操作時可根據說明書的要求控制溫育。室溫溫育時,ELISA闆隻要平置于操作台上即可。應注意溫育的溫度和時間應按規定力求準确。為保證這一點,一個人操作時,一次不宜多于兩塊闆同時測定。
五、 洗滌
洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟,但卻也決定着實驗的成敗。ELSIA就是靠洗滌來達到分離遊離的和結合的酶标記物的目的。通過洗滌以清除殘留在闆孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質,以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的幹擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的,而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的幹擾物質洗滌下來。可以說在ELISA操作中,洗滌是zui主要的關鍵技術,應引起操作者的高度重視,操作者應嚴格按要求洗滌,不得馬虎。
洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外,手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種,過程如下:
(1)浸泡式 a.吸幹或甩幹孔内反應液;b.用洗滌液過洗一遍(将洗滌液注滿闆孔後,即甩去);c.浸泡,即将洗滌液注滿闆孔,放置1-2分鐘,間歇搖動,浸泡時間不可随意縮短;d.吸幹孔内液體。吸幹應徹底,可用水泵或真空泵抽吸,也可甩去液體後在清潔毛巾或吸水紙上拍幹;e.重複操作c和d,洗滌3-4次(或按說明規定)。在間接法中如本底較高,可增加洗滌次數或延長浸泡時間。
微量滴定闆多采用浸泡式洗滌法。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的,非離子型洗滌劑既含疏水基團,也含親水基團,其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合,從而削弱蛋白質與固相載體的結合,并借助于親水基團和水分子的結合作用,使蛋白質回複到水溶液狀态,從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20,其濃度可在0.05%-0.2%之間,高于0.2%時,可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。
(2)流水沖洗式 流水沖洗法zui初用于小珠載體的洗滌,洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來水。洗滌時附接一特殊裝置,使小珠在流水沖擊下不斷地滾動淋洗,持續沖洗2分鐘後,吸幹液體,再用蒸餾水浸泡2分鐘,吸幹即可。浸泡式猶如盆浴,流水沖洗式則好比淋浴,其洗滌效果更為徹底,且也簡便、快速。已有實驗表明,流水沖洗式同樣也适用于微量滴定闆的洗滌。洗滌時設法加大水流量或加大水壓,讓水流沖擊闆孔表面,洗滌效果更佳。
六、顯色和比色
(一) 顯色
顯色是ELISA中的zui後一步溫育反應,此時酶催化無色的底物生成有色的産物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間内,陰性孔可保持無色,而陽性孔則随時間的延長而呈色加強。适當提高溫度有助于加速顯色進行。在定量測定中,加入底物後的反應溫度和時間應按規定力求準确。定性測定的顯色可在室溫進行,時間一般不需要嚴格控制,有時可根據陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況适當縮短或延長反應時間,及時判斷。
OPD底物顯色一般在室外溫或37℃反應20-30分鐘後即不再加深,再延長反應時間,可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色,顯色反應應避光進行,顯色反應結束時加入終止液終止反應。OPD産物用硫酸終止後,顯色由橙黃色轉向棕黃色。
TMB受光照的影響不大,可在室溫中置于操作台上,邊反應觀察結果。但為保證實驗結果的穩定性,宜在規定的适當時間閱讀結果。TMB經HRP作用後,約40分鐘顯色達頂峰,随即逐漸減弱,至2小時後即可完全消退至無色。TMB的終止液有多種,疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間(12-24小時)不褪,是目視判斷的良好終止劑。此外,各類酸性終止液則會使藍色轉變成黃色,此時可用特定的波長(450nm)測讀吸光值。
(二)比色
比色前應先用潔淨的吸水紙拭幹闆底附着的液體,然後将闆正确放入酶标比色儀的比色架中。以軟闆為載體的試驗,需先将闆置于标準96孔的座架中,才可進行比色。zui好在加底物液顯色前,先将軟闆邊緣剪淨,這樣,此闆就可完全平妥坐入座架中。 比色時應先以蒸餾水校零點,測讀底物孔(未經任何反應僅加底物液的孔)和空白孔(以生理鹽水或稀釋液代替标本作全過程的孔),以記錄本次試驗的試劑狀況。其後可用空白孔以蒸餾水校零點,以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度,然後進行計算。
比色結果的表達以往通用光密度(oplical density,OD),現按規定用吸光度(absorbence,A),兩者含義相同。通常的表示方法是,将吸收波長寫于A字母的右下角,如OPD的吸收波長為492nm,表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。
(三) 酶标儀
酶标比色儀簡稱酶标儀,通常指專用于測讀ELISA結果吸光度的光度計。針對固相載體形式的不同,各有特制的适用于闆、珠和小試管的設計。許多試劑公司配套供應酶标儀。酶标儀的主要性能指标有:測讀速度、讀數的準确性、重複性、度和可測範圍、線性等等。優良的酶标儀的讀數一般可到0.001,準确性為±1%,重複性達0.5%。舉例說,若某孔測得的A值為1.083,則該孔相對于空氣的真實A值應為1.083±0.01(1.073~1.093),重複測定數次,其A值均應1.083±0.05(1.078~1.088)在之間。酶标儀的可測範圍視各酶标儀的性能而不同。普通的酶标儀在0.000~2.000,新型号的酶标
儀上限拓寬達2.900,甚至更高。超出可測上限的A值常以"*"或"over"或其它符号表示。應注意可測範圍與線性範圍的不同,線性範圍常小于可測範圍,比如某一酶标儀的可測範圍為0.000~2.900,而其線性範圍僅0.000~2.000,這在定量ELISA中制作标準曲線時應予注意。
酶标儀不應安置在陽光或強光照射下,操作時室溫宜在15~30℃,使用前先預熱儀器15-30分鐘,測讀結果更穩定。
測讀A值時,要選用産物的敏感吸收峰,如OPD用492nm波長。有的酶标儀可用雙波長式測讀,即每孔先後測讀兩次,*次在zui适波長(W1),第二次在不敏感波長(W2),兩次測定間不移動ELISA闆的位置。例如OPD用492nm為W1,630nm為W2,zui終測得的A值為兩者之差(W1-W2)。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光幹擾。
各種酶标儀性能有所不同,使用中應詳細閱讀說明書。
七、 結果判斷
1、 定性測定
定性測定的結果判斷是對受檢标本中是否含有待測抗原或抗體作出"有"或"無"的簡單回答,分别用"陽性"、"陰性"表示。"陽性"表示該标本在該測定系統中有反應。"陰性"則為無反應。用定性判斷法也可得到半定量結果,即用滴度來表示反應的強度,其實質仍是一個定性試驗。在這種半定量測定中,将标本作一系列稀釋後進行試驗,呈陽性反應的zui高稀釋度即為滴度。根據滴度的高低,可以判斷标本反應性的強弱,這比觀察不稀釋标本呈色的深淺判斷為強陽性、弱陽性更具定量意義。
在間接法和夾心法ELSIA中,陽性孔呈色深于陰性孔。在競争法ELISA中則相反,陰性孔呈色深于陽性孔。兩類反應的結果判斷方法不同,分述于下。
(1) 間接法和夾心法
這類反應的定性結果可以用肉眼判斷。目視标本也無色或近于無色者判為陰性,顯色清晰者為陽性。但在ELSIA中,正常人血清反應後常可出現呈色的本底,此本底的深淺因試劑的組成和實驗的條件不同而異,因此實驗中必須加測陰性對照。陰性對照的組成應為不含受檢物的正常血清或類似物(見3.6)。在用肉眼判斷結果時,更宜用顯色深于陰性對照作為标本陽性的指标。
目視法簡捷明了,但頗具主觀性。在條件許可下,應該用比色計測定吸光值,這樣可以得到客觀的數據。先讀出标本(sample,S)、陽性對照(P)、和陰性對照(N)的吸光值,然後進行計算。計算方法有多種,大緻可分為陽性判定值法和标本與陰性對照比值法兩類。
a. 陽性判定值
陽性判定值(cut-off value)一般為陰性對照A值加上一個特定的常數,以此作為判斷結果陽性或陰性的标準。
用此法判斷結果要求實驗條件十分恒定,試劑的制備必須标準化,陽性和陰性的對照品應符合一定的規格,須配用精密的儀器,并嚴格按規定操作。陽性判定值公式中的常數是在這特定的系統中通過對大量标本的實驗檢測而得到的。現舉某種檢測HBsAg的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照品為不含HBsAg的複鈣人血漿,陽性對照品HBsAg的含量标明為P=9±2ng/ml.每次試驗設2個陽性對照和3個陰性對照。測得A值後,先計算陰性對照A值的平均數(NCX)和陽性對照A值的平均數(PCX),兩個平均數的差(P-N)必須大于一個特定的數值(例0.400),試驗才有效。3個陰性對照A值均應≥0.5×NCX,并≤1.5×NCX,如其中之一超出此範圍,則棄去,而已另兩個陰性對照重新計算NCX;如有兩個陰性對照A值超出以上範圍,則該次實驗無效。陽性判定值按下式計算: 陽性判定值=NCX+0.05 标本A值>陽性判定值的為陽性,小于陽性判定值的為陰性。應注意的是,式中0.05為該試劑盒的常數,隻适合于該特定條件下,而不是對各種試劑均可通用。
根據以上叙述可以看出,在這種方法中陰性對照和陽性對照也起到試驗的質控作用,試劑變質和操作不當均會産生"試驗無效"的後果。
b.标本/陰性對照比值
在實驗條件(包括試劑)較難保證恒定的情況下,這種判斷法較為合适。在得出标本(S)和陰性對照(N)的A值後,計算S/N值。也有寫作P/N的,這裡的P不代表陽性(positive),而是病人(patient)的縮寫,不應誤解。為避免混淆,更宜用S/N表示。在早期的間接法ELISA中,有些作者定出S/N為陽性标準,現多為各種測定所沿用。實際上每一測定系統應該用實驗求出各自的S/N的阈值。更應注意的是,N所代表的陰性對照是不含受檢物質的人血清。有的試劑盒中所設陰性對照為不含蛋白質或蛋白質含量較底的緩沖液,以緻反應後産生的本底可能較正常人血清的本底低得多。因此,這類試劑盒規,如N<0.05(或其他數值),則按0.05計算,否則将出現假陽性結果。
(2)競争法
在競争法ELISA中,陰性孔呈色深于陽性孔。陰性呈色的強度取決于反應中酶結合物的濃度和加入競争抑制物的量,一般調節陰性對照的吸光度在1.0-1.5之間,此時反應zui為敏感。
競争法ELISA不易用自視判斷結果,因肉眼很難辨别弱陽性反應與陰性對照的顯色差異,一般均用比色計測定,讀出S、P和N的吸光值。計算方法主要也有兩種,即陽性判定值法和抑制率法。
a. 陽性判定值法
與間接法和夾心法中的陽性判定值法基本相同,但在計算公式中引入陽性對照A值,現舉某種檢測抗HBc的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照為不含抗HBc的複鈣人血漿,陽性對照中抗HBc含量為125±100u/ml.每次試驗設2個陽性對照和3個陰性對照。測得A值後,先計算陰性對照A值的平均值(NCX)和陽性對照A值的平均數(PCX),兩個平均數的差(N-P)必須大于一個特定的數值(例如0.300),試驗才有效。3個陰性對照A值均應小于2.000,而且應≥0.5×NCX并≤1.5×NCX,如其中之一超出此範圍,則棄去,而以另2個陰性對照重新計算×NCX;如有2個陰性對照A超出以上範圍,則該次實驗無效。陽性判定值按下式計算:
陰性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX
标本A值≤陽性判定值的反應為陽性,A>陽性判定值的反應為陰性。
b. 抑制率法
抑制率表示标本在競争結合中标本對陰性反應顯色的抑制程度,按下式計算:
抑制率(%)= (陰性對照A值-标本A值)×100%/陰性對照A值
一般規定抑制率≥50%為陽性,<50%為陰性。
2、定量測定
ELSIA操作步驟複雜,影響反應因素較多,特别是固相載體的包被難達到各個體之間的一緻,因此在定量測定中,每批測試均須用一系列不同濃度的參考标準品在相同的條件下制作标準曲線。測定大分子量物質的夾心法ELISA,标準曲線的範圍一般較寬,曲線zui高點的吸光度可接近2.0,繪制時常用半對數紙,以檢測物的濃度為橫坐标,以吸光度為縱坐标,将各濃度的值逐點連接,所得曲線一般呈S形,其頭、尾部曲線趨于平坦,中央較呈直線的部分是zui理想的檢測區域。
測定小分子量物質常用競争法,其标準曲線中吸光度與受檢物質的濃度呈負相關。标準曲線的形狀因試劑盒所用模式的差别而略有不同。ELISA測定的标準曲線示例見圖4-2.注意圖中橫坐标為對數關系,這更有利于測定系統的表達。
新型酶标儀一般帶有自動軟件可進行定量分析。

中級會員

中級會員

6

推薦收藏該企業網站